Comprende dos rondas de amplificación con dos distintos pares de cebadores en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección.
En la reacción 1: Primers externos para amplificación de una secuencia de ADN extensa que contiene el segmento diana.
Reacción 2: El producto de amplificación se utiliza de molde para una segunda PCR con cebadores internos para amplificar una legión especifica.
Para alcanzar este resultado se necesita:
- El ADN a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento.
- Una enzima capaz de generar una copia de ADN a partir del ADN molde: una ADN polimerasa
- Iniciadores de la reacción: Las enzimas ADN polimerasas únicamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3`libre de una cadena de ADN.
- Nucleótidos libres: las enzimas de ADN polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3`libre del cebador que se ha unido a la cadena molde.
Inicio
- Llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 ºC , que se mantiene durante 1-9 minutos. (solo para ADN polimerasa que requieren activación de calor)
Desnaturalización
- Separar dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno.
- Condiciones tipicas son de 95 ºC por 30 segundos o 97 ºC por 15 segundos.
Alineamiento
- La segunda reacción consiste en la hibridación de los primers.
- Se baja la temperatura y las condiciones serán tales que se facilitará la unión de los primers a la cadena.
- La temperatura (5 ºC ) y tiempo para el alineamiento de los primers dependerá de la composición, tamaño y concentración de los primers amplificadores.
Extensión
- La tercera reacción se efectúa a 72 ºC, a esta temperatura la polimerasa lleva a cabo su acción.
- Insertando los nucleótidos complementarios en el orden que le indica la cadena molde
- El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperarura.
- la extensión del primer se realiza a 72 ºC.
Ciclos
- El ciclismo es esencialmente tomando desnaturalización, hibridación y extensión y haciendo una y otra vez.
Aplicaciones clínicas
- Detección de microorganismos como Rickettsia Bartonella
- Detección de hepesvirus y enterovirus a partir de LCR
- Detección de M. tuberculosis.
PCR MÚLTIPLEX
- Garantiza alta especificidad y sensibilidad desde el primer intento sin largos procesos previos de optimización.
- Cubre una alta gama de aplicaciones en PCR multiplex
- Producto fácil de usar y eficiente en costos
- Reacciones que consiguen amplificar simultáneamente y n un único tubo diferentes secuencias diana.
Aplicaciones
- Multiplex - PCR control de calidad de una muestra: Amplificación de 4 genes constitutivos distintos.
- Multiplex - PCR LAL-B infantil: Amplificación de una de las 4 posibles translocaciones que estudiamos.
- ARMS -PCR: Amplificación por PCR de alelos específicos.
PCR A TIEMPO REAL
También conocida como qPCR o RT-qPCR
También conocida como qPCR o RT-qPCR
La prueba se basa en la reacción en cadena de la ADN polimerasa, donde un fragmento de ADN conocido es copiado y amplificado billones de veces.
El producto del PCR es posteriormente visualizado en un gel de agarosa y proporciona evidencia cualitativa de la presencia de ese fragmento de ADN en la muestra.
El producto del PCR es posteriormente visualizado en un gel de agarosa y proporciona evidencia cualitativa de la presencia de ese fragmento de ADN en la muestra.
La PCR en tiempo real es una modalidad del PCR de punto final, donde la acumulación de ADN amplificado es detectado y cuantificado a medida que la reacción avanza, es decir: “En tiempo real” esto se logra incorporando una molécula fluorescente que se asocia al ADN amplificado, donde el incremento de esta fluorescencia es la proporcional al incremento de la cantidad de moléculas de ADN amplificadas en la reacción.
Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión genética de un gene en estudio en comparación con uno o más genes de referencia
La PCR en tiempo real mediante genes estandarizados permite detectar los genes que codifican varias proteínas.
QF- PCR
Quantitative Fluorescence-Polymerase Chain Reaction.
Es una técnica molecular basada en la utilización de microsatélites para el diagnóstico de aneuploidías.
Mediante la técnica QF-PCR, utilizamos diferentes marcadores microsatélites a lo largo de cada uno de estos 5 cromosomas 13, 18, 21, X e Y para evaluar el numero de copias de cada cromosoma tiene el embrión/feto.
Amplificación de sondas dependiente de ligandos múltiples.
Es un método reciente, basado en la reacción en cadena de la polimerasa (RCP), de cuantificación relativa del número de copias normales y anormales de ácido desoxirribonucleico (ADN) de hasta 40 secuencias genómicas diferentes.
El MLPA nos permite detectar duplicaciones y deleciones dentro de un gen.
Su uso se ha difundido tanto en la investigación como en el diagnóstico clínico. Recientemente, el MLPA se ha utilizado en diagnóstico prenatal y en el estudio de abortos.
